解决Co-IP实验抗体重、轻链污染难题：关键策略与实用方法

在进行Co-IP实验时，我们常常会遇到让人非常头疼的抗体轻重链污染，下面6686体育生物和大家一起探讨这些问题产生的原因和解决方法，帮助大家制定更合理的实验方案。

一．为什么IP时会有抗体轻重链污染？

众所周知，Co-IP是研究蛋白与蛋白相互作用的技术，基于抗体和抗原特异性结合的原理，采用结合了目标蛋白抗体的beads，调取样本中天然结合的目标诱饵蛋白（Bait）及其互作蛋白，去除未结合的蛋白后，再将复合物从beads上洗脱下来，进行后续western-blot或质谱鉴定。

IP时会有抗体轻重链污染

由上图可知，免疫沉淀复合物包括：Beads、抗体（约25kD的轻链+约55kD的重链蛋白）、诱饵蛋白和互作蛋白。为了检测复合物中的蛋白，必须将这些蛋白与抗体、beads分离。无论变性还是非变性洗脱方法，都不可避免的会将IP抗体一起洗脱下来，使之残留在最终的洗脱液中。

当后续进行western-blot检测时，洗脱液中的IP抗体也会被转移到膜上，因此WB二抗不仅会识别WB一抗，还会识别这些残留的IP抗体，导致结果图中除了目标蛋白条带，还常常有抗体的轻链和重链条带。如果恰好目标蛋白条带也在55 kDa或25 kDa左右，则会和轻重链条带混淆在一起而无法区分。

当后续进行时，IP抗体也被一起酶解和进入质谱仪，由于抗体的绝对含量远高于样本中蛋白的含量，这些肽段会有更大概率的被检测到，从而了降低了其他低丰度蛋白的检出概率，导致鉴定的互作蛋白更少。

二．怎么解决抗体轻重链污染？

技术人员想了一系列的方法来减少抗体轻重链对IP结果的干扰，例如：

1、IP抗体选用共价偶联到beads上的抗体；

2、IP抗体选用没有恒定区的纳米抗体；

3、选用直接标记HRP的一抗；

4、选用只识别天然构象抗体或只识别抗体轻链或重链的二抗。

其中方法1和2的抗体不仅售价很高，而且很多时候根本买不到。方法3和4只能掩盖Western-blot检测时的轻重链干扰，并不能真正消除这些污染，如果IP后的蛋白需要做质谱，它们则无用武之地。除此之外，我们还能怎么办呢？

虽然我们很难买到偶联beads的诱饵蛋白抗体，但是我们能很容易买到偶联beads的标签抗体呀！当在样本中过表达带标签（例如Flag、GFP等）的诱饵蛋白时，相当于给蛋白带上了“尾巴”，用这个“尾巴”的抗体beads来做IP，不仅方便，而且成本低，易于购买。目前，生产标签抗体磁珠的厂家很多，最常见的是将普通的flag抗体直接偶联在beads，可是当小伙伴儿们真正开始实验时，却发现偶联的flag抗体依旧会残留在IP洗脱液中，这是为什么呢？

事实上抗体并不是个单一蛋白，是由两条重链和两条轻链蛋白共价偶联成的多聚体结构，如果不能保证4条链都完全偶联在beads上，还是会有抗体污染，尤其当用到比较强烈的洗脱方法时（例如加入WB loading buffer煮样洗脱），这种污染尤为严重。

难道没有完全无污染的抗体beads吗？当然有！结合多年的互作实验和质谱经验，6686体育生物开发了专门解决轻重链污染问题的ChainFree^TM标签抗体磁珠，涵盖了目前主流的多种标签，比如Flag、HA、Myc、V5、GFP、mCherry。该磁珠上偶联了经过严格筛选、优化并重组表达的无轻、重链的标签抗体，完全解决了抗体污染问题，并且采用的是定向偶联技术，抗体磁珠对诱饵蛋白的亲和力很强，每次IP实验最多使用20ul就可以达到很好的效果，尤其当目标蛋白很难表达或者细胞很难转染时，这个磁珠就可以极大的发挥优势。